Kişisel yazılar, günlük notlar, okuma kayıtları ve konu arşivleri için sade bir blog alanı.

Gemini_Generated_Image_vbf0ttvbf0ttvbf0.png

Rekombinant Protein Ekspresyonunda E. coli Suşu Seçim Rehberi

Moleküler biyoloji laboratuvarlarında yüksek lisans yapmanın yazılı olmayan ilk kuralı şudur: Her Escherichia coli aynı değildir. Klonlama yaparken hücre çeperi

Moleküler biyoloji laboratuvarlarında yüksek lisans yapmanın yazılı olmayan ilk kuralı şudur: Her Escherichia coli aynı değildir. Klonlama yaparken hücre çeperini nazikçe geçtiğiniz o DH5\alfa suşu, iş protein ekspresyonuna geldiğinde tam bir hayal kırıklığına dönüşebilir. Çünkü klonlama suşları plazmidi korumak ve çoğaltmak için evrimleşmişken, ekspresyon suşları protein fabrikası gibi çalışmak üzere genetik olarak modifiye edilmiştir.

Tez konunuz veya projeniz kapsamında bir rekombinant proteini yüksek verimle ve çözünür (soluble) formda üretmek istiyorsanız, genotiplerin o karmaşık dünyasında doğru suşu seçmek zorundasınız. Gelin; laboratuvar tezgahındaki o meşhur petri kaplarının arkasındaki genetik şifreleri çözelim ve proteininizin karakterine en uygun E. coli işçisini birlikte seçelim.

Temel Fabrika: BL21 ve BL21(DE3) Kültü

Eğer proteininiz özel bir modifikasyon veya nadir kodon optimizasyonu gerektirmeyen, nispeten "uysal" bir protein ise, ilk seçeceğiniz suş BL21 veya onun türevleridir.

  • Neden BL21? Bu suş, E. coli’nin B serisinden türetilmiştir ve iki kritik endojen proteazdan yoksundur: Lon (sitoplazmik proteaz) ve OmpT (dış zar proteazı). Bu proteazların genetik olarak nakavt edilmiş olması, sentezlediğiniz rekombinant proteinin daha hücre içindeyken parçalanmasını (proteolizis) engeller.
  • DE3 Ne Anlama Gelir? Eğer plazmidiniz T7 promotör sistemine (örneğin pET vektörleri) sahipse, düz bir BL21 işinize yaramaz. BL21(DE3) kullanmalısınız. "DE3" ibaresi, bakterinin genomuna lambda pro-fajı aracılığıyla T7 RNA Polimeraz geninin entegre edildiğini gösterir. Siz ortama IPTG eklediğinizde, bakterinin kendi kromozomundan T7 RNA polimeraz sentezlenir ve gidip sizin plazmidinizdeki T7 promotörünü çılgınca çalıştırır.

Toksik Proteinlerle Mücadele: BL21 pLysS ve Tuner Suşları

Yüksek lisans öğrencilerinin en büyük kabuslarından biri, eksprese etmek istedikleri proteinin E. coli için toksik olmasıdır. Hücreler büyür ama IPTG indüksiyonu yapıldığı an (ya da daha indüksiyon yapmadan) kültür ölmeye başlar. Çünkü T7 sistemi bazal düzeyde de olsa "sızdırır" (leaky expression). Siz daha indüksiyon yapmadan üretilen az miktardaki toksik protein, bakteriyi öldürür.

  • BL21 pLysS: Bu suş, içinde T7 lizozim enzimini kodlayan küçük bir plazmid (pLys) barındırır. T7 lizozimi, ortamda IPTG yokken sızan T7 RNA polimeraz moleküllerine bağlanarak onları inhibe eder. Böylece indüksiyon öncesi protein sentezi tamamen sıfırlanır. IPTG eklediğinizde ise bariyer aşılır ve kontrollü ekspresyon başlar.
  • Tuner(DE3): Eğer ekspresyonu "hep ya da hiç" şeklinde değil de, bir vanayı açar gibi milimetrik olarak ayarlamak istiyorsanız Tuner suşunu seçmelisiniz. Bu suş, laktoz permeaz (lacY) mutasyonuna sahiptir. Bu sayede IPTG hücre içine aktif taşıma ile değil, difüzyonla homojen olarak girer. IPTG konsantrasyonunu değiştirerek protein üretim hızını regüle edebilir, böylece proteinin toksisitesini veya agresif üretimden kaynaklı çökelmesini engelleyebilirsiniz.

İşte ökaryotik bir proteini (örneğin bir insan veya bitki proteinini) E. coli'de üretirken duvara tosladığımız o meşhur nokta: Kodon Yanlılığı (Codon Bias).

Kodon Uyuşmazlığı ve Nadir Kodon Çözümleri: Rosetta ve BL21 CodonPlus

İşte ökaryotik bir proteini (örneğin bir insan veya bitki proteinini) E. coli'de üretirken duvara tosladığımız o meşhur nokta: Kodon Yanlılığı (Codon Bias).

İnsan genomunda arginin, lösin, izolösin, prolin ve glisin için sıkça kullanılan bazı kodonlar, E. coli'nin tRNA havuzunda son derece nadir bulunur (örn: AGG/AGA için Arginin, AUA için İzolösin). Bakteri ribozomu bu kodonlara geldiğinde uygun tRNA bulamaz, duraksar ve sentezi yarıda keser (truncation) ya da yanlış amino asit yerleştirir.

  • Rosetta(DE3): Genomunda, E. coli'de nadir bulunan 6 adet ökaryotik tRNA genini (AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA) taşıyan uyumlu bir plazmid barındırır. Protein diziniz kodon optimizasyonlu değilse, Rosetta yüksek lisans tezinizin kurtarıcısı olacaktır.
  • BL21 CodonPlus: Benzer şekilde stratejik tRNA kopyalarını içerir. Özellikle AT-zengin veya GC-zengin organizmaların genlerini eksprese ederken ribozom duraklamalarını ortadan kaldırır.

Disülfit Bağları ve Doğru Katlanma (Folding): Origami ve SHuffle Suşları

Protein ekspresyonunda tek amaç yüksek miktarda protein üretmek değildir; proteinin biyolojik olarak aktif (functional) olması gerekir. Birçok ökaryotik protein, kararlı üç boyutlu yapıya ulaşabilmek için sistein amino asitleri arasında disülfit bağlarına (S-S) ihtiyaç duyar. Ancak E. coli sitoplazması aşırı indirgeyici (reducing) bir ortamdır ve burada disülfit bağları oluşamaz; oluşanlar da hemen yıkılır. Protein yanlış katlanır ve çözünmeyen inklüzyon cisimciği (inclusion body) olarak çöker.

Origami(DE3): Bu suş, sitoplazmayı indirgeyici tutan iki temel enzim olan thioredoxin reductase (trxB) ve glutathione reductase (gor) genlerinde mutasyona sahiptir. Bu sayede sitoplazma daha oksidatif bir hale gelir ve protein daha sentezlenirken sitoplazma içinde disülfit bağları kurulabilir.

SHuffle: New England Biolabs tarafından geliştirilen bu suş, Origami'nin bir adım ötesidir. trxB/gor mutasyonlarına ek olarak, periplazmada bulunan ve disülfit bağlarının doğru eşleşmesini denetleyen DsbC şaperon/izomeraz enzimini sitoplazmada eksprese edecek şekilde modifiye edilmiştir. Eğer proteininiz antikor fragmanı (scFv) veya karmaşık disülfit bağları içeren bir enzimse, SHuffle suşu sizin için biçilmiş kaftandır.

Sonuç: Karar Matrisi

Yüksek lisans projenize başlarken kendinize şu soruları sorun ve rotanızı belirleyin:

  • Vektörüm T7 sistemine mi ait? DE3 türevlerini seçin.
  • Genim ökaryotik kökenli mi ve kodon optimizasyonu yapılmadı mı? Rosetta kullanın.
  • Protein yapısında çok sayıda disülfit bağı var mı? SHuffle veya Origami test edin.
  • Protein hücreyi öldürüyor mu? pLysS ile kaçak ekspresyonu baskılayın veya indüksiyon sıcaklığını 18 derece'ye düşürerek Tuner suşunu deneyin.

Unutmayın, rekombinant protein ekspresyonu biraz da deneme-yanılma sanatıdır. Laboratuvar günlüğünüze suşların genotiplerini ve sonuçlarını titizlikle kaydetmek, tezinizin savunma gününde jürinin karşısına alnınız ak çıkmanızı sağlayacaktır.

Referanslar

  1. Bhatwa, A., Jens, W., Dunnett, P., & van Dijl, J. M. (2021). Optimization of recombinant protein production in Escherichia coli. International Journal of Molecular Sciences, 22(14), 7432. https://doi.org/10.3390/ijms22147432
  2. Burgess-Brown, N. A., Sharma, S., Sobott, F., Loenarz, C., Oppermann, U., & Gileadi, O. (2008). Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification, 59(1), 94-102. https://doi.org/10.1016/j.pep.2008.01.008 (Rosetta ve CodonPlus mekanizmaları için)
  3. Gopal, G. J., & Kumar, A. (2013). Strategies for the production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. International Journal of Cell Biology, 2013, 1-11. https://doi.org/10.1155/2013/919504 (İnklüzyon cisimcikleri ve çözünürlük sorunları için)
  4. Lobstein, J., Emrich, C. A., Jeans, C., Faulkner, M., Riggs, P., & Berkmen, M. (2012). SHuffle, a novel Escherichia coli protein expression strain capable of correctly folding disulfide-bonded proteins in its cytoplasm. Microbial Cell Factories, 11(1), 56. https://doi.org/10.1186/1475-2859-11-56 (SHuffle suşunun orijinal mühendislik makalesi)
  5. Prinz, W. A., Aslund, F., Holmgren, A., & Beckwith, J. (1997). The role of the thioredoxin and glutaredoxin pathways in reducing disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm. Journal of Biological Chemistry, 272(25), 15661-15667. https://doi.org/10.1074/jbc.272.25.15661 (Origami suşunun temelini oluşturan trxB/gor mutasyonlarının mekanizması)
  6. Rosano, G. L., & Ceccarelli, E. A. (2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: Advances and challenges. Frontiers in Microbiology, 5, 172. https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00172
  7. Schumann, W., & Ferreira, L. C. (2004). Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Genetics and Molecular Biology, 27(3), 442-453. https://doi.org/10.1590/S1415-47572004000300022
  8. Singha, T. K., Gulati, P., Antony, A., & Kapoor, V. (2017). Insights into T7 RNA polymerase compatible expression systems in Escherichia coli for recombinant protein production. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 15(2), 293-299. https://doi.org/10.1016/j.jgeb.2017.07.009 (DE3 ve pLysS sistemlerinin mekanizması)
  9. Studier, F. W. (2005). Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification, 41(1), 207-234. https://doi.org/10.1016/j.pep.2005.01.016 (Otomatik indüksiyon ve lacY ilişkisi için temel makale)
  10. Terpe, K. (2006). Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: From molecular biology to commercialized product. Applied Microbiology and Biotechnology, 72(2), 211-222. https://doi.org/10.1007/s00253-006-0465-8

Sık Sorulan Sorular

Bu içerik hakkında merak edilenler

İçerik yükleme panelinde eklenen soru-cevaplar burada görünür.

Klonlama için neden DH5 alpha veya Top10 seçilirken, ekspresyon için BL21 seçilmelidir?

DH5 alpha ve Top10 gibi suşlar endA1 (endonükleaz mutasyonu sayesinde plazmid DNA izolasyon kalitesini artırır) ve recA1 (homolog rekombinasyonu engelleyerek plazmid bütünlüğünü korur) genotiplerine sahiptir; ancak yüksek miktarda proteaz içerirler ve T7 RNA polimeraz sistemleri yoktur. BL21 ise lon ve ompT proteazlarından yoksun olduğu için sentezlenen proteini korur. Dolayısıyla biri plazmid taşımak, diğeri ise protein üretmek için optimize edilmiştir.

BL21(DE3) suşundaki "DE3" lizojeni tam olarak ne iş yapar ve indüksiyon mekanizması nasıldır?

DE3, bakterinin genomuna entegre edilmiş bir lambda pro-faj dizisidir ve lac UV5 promotörü kontrolü altında T7 RNA Polimeraz genini taşır. Ortama IPTG eklendiğinde, Lac represörü promotörden ayrılır ve bakteri kendi T7 RNA polimerazını sentezler. Bu polimeraz ise plazmidinizdeki T7 promotörünü tanıyarak hedef geninizin yüksek düzeyde transkripsiyonunu başlatır.

T7 sisteminde "Sızdıran (Leaky) Ekspresyon" nedir ve pLysS plazmidi bunu nasıl çözer?

Leaky ekspresyon, ortama indükleyici (IPTG) eklenmediği halde lac promotörünün tam olarak baskılanamaması ve bazal düzeyde T7 RNA polimeraz (ve dolayısıyla hedef protein) sentezlenmesi durumudur. Hedef protein toksik ise bu durum hücreleri indüksiyondan önce öldürür. pLysS plazmidi, sürekli olarak T7 lizozim üretir. Bu enzim, sızan T7 RNA polimeraz moleküllerine bağlanarak onları inaktive eder ve kaçak ekspresyonu durdurur.

Rosetta suşlarındaki "Kodon Yanlılığı (Codon Bias)" problemi kromatografik saflaştırmada nasıl bir hata tablosu yaratır?

Eğer hedef protein nadir kodonlar içeriyorsa ve hücrede uygun tRNA yoksa, ribozom o kodonda takılır. Bu takılma ya translasyonun erken sonlanmasına (truncated protein - eksik zincir) ya da ribozom kayması (frameshift) nedeniyle yanlış amino asit yerleşimine neden olur. Afinite kromatografisinde (örn: His-Tag) jeli yüklediğinizde, hedef bandınızın altında çok sayıda küçük, kırpılmış, istenmeyen kontaminant protein bantları görürsünüz.

Origami suşunun genotipindeki trxB ve gor mutasyonlarının hücresel mekanizması nedir?

trxB (Thioredoxin reductase): Tioredoksini indirgenmiş formda tutan enzimdir.
gor (Glutathione reductase): Glutatyonu indirgenmiş formda tutan enzimdir.
Bu iki gen mutasyona uğradığında, sitoplazmadaki tioredoksit ve glutatyon havuzları oksitlenmiş formda kalır. İndirgeyici güç ortadan kalktığı için sitoplazma oksidatif bir karakter kazanır ve sistein sülfhidril (-SH) grupları kararlı disülfit bağları ($-S-S-$) oluşturabilir.

SHuffle suşu ile Origami suşu arasındaki en temel genetik ve fonksiyonel fark nedir?

Her iki suş da sitoplazmayı oksidatif yapmak için trxB ve gor mutasyonlarına sahiptir. Ancak Origami'de disülfit bağları rastgele oluşabilir ve bu da yanlış katlanmaya (misfolding) yol açabilir. SHuffle suşu ise buna ek olarak, normalde sadece periplazmada çalışan ve yanlış eşleşmiş disülfit bağlarını koparıp doğrusunu kuran DsbC (disulfide bond isomerase) enzimini sitoplazmada kalıcı olarak eksprese eder. Yani SHuffle sadece bağ oluşturmaz, bağların doğru eşleşmesini de denetler.

İnklüzyon cisimciği (Inclusion Body) oluşumu bir suş hatası mıdır, nasıl çözülür?

Her zaman suş hatası değildir; genellikle proteinin bakterinin katlanma kapasitesinden çok daha hızlı ve agresif sentezlenmesinden kaynaklanır. Çözüm için öncelikle indüksiyon sıcaklığı 18 - 20 derece'ye düşürülmeli ve IPTG konsantrasyonu azaltılmalıdır (Tuner suşu bu aşamada etkilidir). Eğer protein yapısı gereği çökmeye meyilliyse, moleküler şaperon ko-ekspresyonu yapan suşlar ya da SHuffle/Origami gibi katlanmaya yardımcı suşlar tercih edilmelidir.

BL21(DE3) suşunda pET vektörü kullanırken neden glikoz eklenmesi önerilir?

Kültür medyumuna (örneğin LB veya 2YT) %0.5 - %1 oranında glikoz eklenmesi, Katabolit Baskılaması (Catabolite Repression) mekanizmasını devreye sokar. Hücre ortamda glikoz varken cAMP seviyesini düşürür, bu da lac promotörünün aktivasyonunu baskılar. Böylece IPTG ekleyene kadar leaky (kaçak) ekspresyon maksimum düzeyde engellenmiş olur. Ancak indüksiyon öncesi medyumun değiştirilmesi veya glikozun tükenmiş olması gerekir çünkü glikoz varlığında IPTG indüksiyon verimi düşebilir.

Bir suşun genotipinde yer alan F- ve hsdSb (rB\ mB-) sembolleri ne anlama gelir?

F^-: Hücrenin F plazmidi taşımadığını, yani konjugasyon yeteneğinin olmadığını gösterir.
hsdSb(rB\ mB)$: Bakterinin kendi restriksiyon modifikasyon sisteminin mutasyonlu olduğunu gösterir. Hücre, dışarıdan gelen yabancı plazmidi parçalayamaz (rB) ve onu kendi DNA'sı gibi metilleyemez (mB). Bu, rekombinant plazmidin hücre içinde stabil kalması için kritiktir.

Otomatik indüksiyon medyumu (Auto-induction medium) kullanırken hangi suş özellikleri dikkate alınmalıdır?

Otomatik indüksiyon medyumları (örn: Studier medyumu), ortamdaki glikoz, laktoz ve gliserol oranlarının dengesine dayanır. Bakteri önce glikozu tüketir (büyüme fazı), glikoz bitince laktozu metabolize etmeye başlar ve bu sırada lac promotörü kendiliğinden (IPTG eklemeden) indüklenir. Bu sistemi kullanabilmek için suşun lacY+ (laktoz permeaz pozitif) olması gerekir, çünkü laktozun hücre içine etkin şekilde taşınması şarttır. Dolayısıyla lacY mutasyonu içeren Tuner gibi suşlar standart otomatik indüksiyon protokolleri için uygun değildir.

Video dosyası eklenmedi.
Ses dosyası eklenmedi.
Belge eklenmedi.

Önerilen İçerikler

Bu içerikle bağlantılı seçkiler

Yorum Yap

İçerik hakkında yorum bırak.

Bu içerik altındaki son yorumlar.

Henüz yorum yapılmadı. İlk yorumu sen bırakabilirsin.