Makas"ın Ötesine Geçmek
CRISPR-Cas9 devrimi, bilim camiasına programlanabilir bir "moleküler makas" sağladı. Ancak, araştırmalar klinik aşamalara ilerledikçe, Çift Zincir Kırılmaları (DSB) oluşturmanın sınırlamaları belirginleşti. DSB'ler genellikle Homolog Olmayan Uç Birleştirme (NHEJ) yoluyla kontrolsüz eklemeler veya silmeler (indeller) tetikler ve bu da genotoksisiteye veya istenmeyen gen nakavtlarına yol açabilir. Hassas tıp alanına odaklanan araştırmacılar için hedef, "kesmekten" "kimyasal yeniden yazmaya" kaymıştır. Bu makale, genomik stabilite ve terapötik etkinliğin sınırlarını yeniden tanımlayan iki teknoloji olan Baz Düzenleme ve Prime Düzenlemenin biyokimyasal nüanslarını inceliyor.
Baz Düzenlemesinin Moleküler Mantığı
Baz editörleri, "ölü" veya "nükleaz" Cas9'un (dCas9/nCas9) hedefleme yeteneğini nükleozit deaminazların katalitik gücüyle birleştiren kimerik proteinlerdir. İki ana sınıf vardır: Sitozin Baz Editörleri (CBE'ler) ve Adenin Baz Editörleri (ABE'ler).
CBE'ler, Sitozini (C) Urasile (U) dönüştürmek için bir sitidin deaminaz (APOBEC1 gibi) kullanır. Hücresel bağlamda, Urasil, DNA replikasyonu sırasında Timin (T) olarak okunur. Hücrenin doğal Urasil DNA Glikozilazının (UNG) U'yu tekrar C'ye dönüştürmesini önlemek için, bu editörler genellikle bir Urasil Glikozilaz İnhibitörü (UGI) ile birleştirilir. Öte yandan, ABE'ler, Adenini (A) İnozine (I) dönüştürmek için tasarlanmış bir deoksiadenozin deaminaz (TadA) kullanır; bu da hücresel mekanizma tarafından Guanin (G) olarak yorumlanır.
Baz düzenlemenin akademik önemi, insan patojenik genetik varyantlarının yaklaşık %60'ını oluşturan "nokta mutasyonlarını" çift sarmal kırılmalarıyla ilişkili kromozomal translokasyon riski olmadan düzeltebilme yeteneğinde yatmaktadır. Bununla birlikte, "yan etki düzenlemesi" teknik bir engel olmaya devam etmektedir. "Aktivite penceresi" (tipik olarak 4-8 nükleotid) içinde birden fazla C veya A mevcutsa, enzim bunların hepsini değiştirebilir ve potansiyel olarak yeni eş anlamlı veya eş anlamlı olmayan mutasyonlar oluşturabilir.
Prime Editing: Çok Yönlü "Arama ve Değiştirme" Sistemi
2019 yılında Liu Laboratuvarı tarafından geliştirilen Prime Editing, bir paradigma değişimini beraberinde getirdi. Belirli geçişlerle (C→T veya A→G) sınırlı olan baz editörlerinin aksine, Prime Editörler, hedefli ekleme ve silme işlemlerinin yanı sıra, mümkün olan on iki bazdan baza dönüşümün tamamını gerçekleştirebilir.
Prime düzenleme kompleksi, tasarlanmış bir ters transkriptaz (RT) ile birleştirilmiş bir nCas9 ve çok işlevli bir "prime düzenleme kılavuz RNA'sı" (pegRNA) içerir. PegRNA, işlemin "beyni"dir: hedefi bulmak için bir ara dizi, kesilmiş DNA'yı sabitlemek için bir primer bağlanma bölgesi (PBS) ve istenen düzenlemeyi içeren bir şablon dizisi içerir.
nCas9 "PAM-ipliğini" kestiğinde, pegRNA'nın PBS'si hedef DNA'ya hibritleşir. Ardından RT, pegRNA şablonuna göre DNA ipliğini uzatır. Bu, düzenlemeyi içeren bir "3' kanat" ve orijinal diziyi içeren bir "5' kanat" oluşturur. Kanat dengelemesi ve hücresel DNA onarımı süreciyle, düzenlenmiş dizi genoma dahil edilir. Prime Editing, donör DNA şablonu veya çift sarmal kırılmaları gerektirmediği için, geleneksel Homoloji Yönlendirmeli Onarıma (HDR) kıyasla primer hücrelerde ve in vivo modellerde önemli ölçüde daha verimlidir.
"Hedef Dışı" Ortamda Yolculuk
Gen terapisi alanında çalışan herhangi bir akademisyen için "hedef dışı" etkiler birincil endişe kaynağıdır. Baz düzenleyiciler bazen RNA düzeyinde deaminasyona neden olabilir; bu durumda deaminaz, hedef DNA yerine hücresel RNA üzerinde etki gösterir. Prime Editing, üç ayrı hibritleşme olayını (ara DNA, PBS DNA ve flap DNA) gerektirmesi nedeniyle teorik olarak klasik CRISPR'dan daha spesifiktir.
Ancak, bu araçların boyutu lojistik bir zorluk teşkil etmektedir. Prime Editor, genellikle standart Adeno-Associated Virus (AAV) vektörlerinin taşıma kapasitesini aşan devasa bir protein-RNA kompleksidir. Araştırmacılar şu anda, editörün ikiye bölündüğü ve yalnızca hedef hücre içinde yeniden oluşturulduğu "bölünmüş intein" dağıtım sistemlerini araştırmaktadır. Ayrıca, "daireselleştirilmiş pegRNA'ların" (cpegRNA'lar) kullanımının, kılavuz RNA'nın stabilitesini artırdığı ve böylece merkezi sinir sistemi gibi ulaşılması zor dokularda düzenleme verimliliğini artırdığı yakın zamanda gösterilmiştir.
Klinik Çeviriye Giden Yol
"CRISPR 3.0"a doğru ilerlerken, odak noktası "PAM içermeyen" veya "PAM esnek" Cas varyantları (SpRY gibi) üzerindedir. Bu tasarlanmış proteinler, genomdaki hemen hemen her diziyi tanıyabilir ve hedefin belirli bir NGG motifine bitişik olması gerektiği kısıtlamasını ortadan kaldırır. Bu hassasiyet seviyesi, daha önce erişilemeyen düzenleyici elementleri, güçlendiricileri ve derin intronik mutasyonları hedeflememizi sağlar.
Doktora öğrencisi veya proje yürütücüsü için, Base ve Prime düzenleme arasındaki seçim, belirli biyolojik soruya bağlıdır. Base düzenleme, basit geçişler için daha yüksek verimlilik sunarken, Prime düzenleme karmaşık ekleme/çıkarma mutasyonları için eşsiz bir esneklik sunar. Alanın geleceği, bu araçların hibrit kullanımında, belki de metabolik susturma için Base düzenleyicilerin ve yapısal gen düzeltmesi için Prime düzenleyicilerin kullanılmasında yatmaktadır.
Referanslar
1. Anzalone, A. V., et al. (2019). Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature, 576(7785), 149-157.
2. Gaudelli, N. M., et al. (2017). Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 551(7681), 464-471.
3. Komor, A. C., et al. (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 533(7603), 420-424.
4. Rees, H. A., & Liu, D. R. (2018). Base editing: Precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics, 19(12), 770-788.
5. Kantor, A., et al. (2020). CRISPR-Cas9, Cas12a, and Cas13a: A guide to mastery. Molecular Therapy, 28(11), 2312-2325.
6. Newby, G. A., & Liu, D. R. (2021). In vivo somatic cell gene editing with base editors and prime editors. Trends in Genetics, 37(12), 1111-1124.
Henüz yorum yapılmadı. İlk yorumu sen bırakabilirsin.